问：祝贺你最近发表在《科学》杂志上的文章，其中揭示了植物如何制造柠檬苦素的秘密，这些柠檬苦素有可能用作抗癌药物。首先，请与我们分享你的教育和培训背景。
答：我在埃克塞特大学（英国）完成了分子生物学本科学位。这是一个广泛的学位，从生物化学到海洋生物学，包括在昆士兰大学（澳大利亚）学习一年，我喜欢它，并且真正让我大开眼界，了解到植物和作物科学的研究是多么有趣和多样化。此后，2015年，我在伯明翰（英国）的NHS测序实验室短暂担任医疗保健科学助理。然后搬到诺里奇（英国）攻读博士学位，我于2020年在约翰英尼斯中心（John Innes Centre, JIC）由安妮教授（Dr. Anne’s Osbourn）主持的奥斯本小组完成了关于柠檬苦素生物合成的研究。这是一个很棒的项目，当我开始研读博士时，这条途径完全没有特征，但随著项目的进展，该项目的广度使我能够接受大量不同的技能培训。

问：请告诉我们更多关于这项发表在《科学》杂志的研究.
答：柠檬苦素是一种化学物质（或植物天然产物），仅由属于桃花心木或柑橘科的植物所制成。在《科学》杂志上发表的文章中，我们解释了如何发现和表征生产简单柠檬苦素所需的所有酶（生物机器），如氮杂二酮（来自桃花心木家族）和 基达内酯 khidalactone A（来自柑橘家族）。文章描述了22种新酶，其中12种来自柑橘属植物，10种来自桃花心木，其中一些具有新的化学作用。例如，通过进行支架重排，我们首次发现参与非常保守的甾醇初级代谢的酶已经在桃花心木和柑橘中进化，在柠檬苦素的生物合成中发挥关键作用。 桃花心木（Mahogany）系列的工作由我和JIC的同事进行，柑橘（Citrus）则由斯坦福大学的合作者进行。这项工作面临许多挑战，例如，在我们对桃花心木酶进行微调之前，我们首先必须为苦楝（Melia azedarach，该家族中的一种柠檬苦素生产树），生成基因组和表达数据。随著基因测序技术、代谢物分析和生物技术的进步，现在可以表征真正复杂的植物天然产物途径，例如我们对柠檬苦素所做的研究。但是在2016年我开始攻读博士学位时，这项工作几乎不可能达成。

问：是什么让柠檬苦素如此有趣？
答：柠檬苦素是一组极其多样化的化学物质（迄今为止已鉴定出 2,000 多种）。它们是一种称为三萜类化合物（triterpenes）的化学物质，具有30个碳主链的多环结构。与其他三萜类化合物不同，柠檬苦素类化合物的化学支架被广泛重排。在柠檬苦素的生物合成中，会形成一个呋喃环，导致4个碳的损失，这是我们在《科学》杂志论文中首次描述的过程。柠檬苦素生物合成中，可能会出现各种其他环开口，其中之一在我们的《科学》杂志论文中得到了表征。这些环开口，加上广泛的氧化，构成了柠檬苦素的巨大多样性，使它们让化学家如此著迷。此外，许多柠檬苦素具有生物活性，但对人类无毒，因此对人类具有当前和潜在的未来用途。最著名的例子是来自桃花心木类的印楝树的柠檬苦素，即印苦楝子素。印苦楝子素是一种有效的昆虫拒食剂/毒剂，可在环境中迅速降解，被认为对蜜蜂友好。因此，印苦楝子素是一种强大的作物保护剂，基于印楝种子的溶液可用于传统和商业配方。除了作物保护用途外，柠檬苦素的许多潜在药物用途也有报导，最突出的是印苦楝内酯（nimbolide）的抗癌作用，这是另一种印楝类柠檬苦素。

问：你在进行这项研究时，使用了什么方法和设备？
答：首先，我们使用下一代测序技术（PacBio、Hi-C 和 RNA-seq）为苦楝（印楝的近亲）生成了基因组和表达数据。然后我们利用这些资源寻找我们怀疑可能参与柠檬苦素生物合成的候选酶。为实现这一目标，我们主要采用表达分析方式（确定植物不同组织中酶的“开启”或“关闭”方式）。我们使用了苦楝（M.azedarach）的表达模式，此表达模式已经在我们于2019年发表的PNAS论文（叶柄和根中柠檬苦素生物合成酶的高表达）中建立，以找到具有相似表达模式的酶。一旦我们有了候选酶的列表，我们就克隆它们，然后在烟草类（本塞姆氏烟草）宿主植物中使用瞬时表达来测试不同的酶组合，并由一种特殊的细菌“农杆菌”做介导。该系统使酶得以在植物中表达并让我们轻松分析这些在宿主植物而非原本植物中的酶的活性。通过LCMS（液相色谱-质谱法）来分析由这些酶所引起的化学变化。最后，如果通过LCMS，我们确定了一种不知道其结构的新化学物质，我们会进行大规模的瞬时表达（使用真空渗透器来加速该过程），然后使用制备型HPLC来纯化新产生的未知化学结构。一旦我们有了一种纯化学物质，我们就可以通过NMR（核磁共振）确认其结构，以及每种酶的活性。

问：通过揭示完整生物合成途径中的酶，你的下一步研究是什么？
答：虽然我们现在知道简单的柠檬苦素的完整生物合成途径，如氮杂二酮，但对更复杂的柠檬苦素如印苦楝子素（azadirachtin），还有更多的生物合成步骤仍然未知。我们希望了解接下来的步骤，以便能够制造出更有用/更复杂的柠檬苦素。此外，与我们发表在《科学》杂志论文中发现的22种酶一样，柠檬苦素的复杂性意味著我们很可能会在剩余的印苦楝子素途径中发现有趣且新颖的酶，这使它成为一个非常令人兴奋的项目。最后，我也对如何提高寄主植物（本塞姆氏烟草）的柠檬苦素产量感兴趣。鉴于如果我们能够制造更多的柠檬苦素，这对工业和一般人类来说可能更有用。

问：如何用不同于现有方法的新生产方法，从生产柠檬苦素的植物中提取化合物？
答：目前获取柠檬苦素的唯一方法是从生产柠檬苦素的植物中提取它们。这个过程如果依赖于大量的植物原材料，例如
印楝种子，可能很困难/很贵。此外，大多数柠檬苦素的结构由于其复杂性而无法进行有效的商业化学合成。以印苦楝子素为例，可以化学合成，但该过程需要71步，收率仅为0.00015%。现在已知像氮杂二酮这样的简单柠檬苦素的生物合成途径，有可能（通过一些工作和优化）在宿主生物体（例如酵母或烟草）中表达该途径作为替代生产途径。如此就不会依赖于植物原材料，并且通过正确的优化，可以提供相对较高的产量。或者，可以对作物物种进行工程改造，使其产生自己的柠檬苦素，从而保护自己免受害虫侵害，如此就无需喷洒或其他形式的作物保护应用。

问：你还想开发哪些其他高价值的柠檬苦素，为什么？
答：我们对印苦楝子素和相关的柠檬苦素（如沙兰宁）非常感兴趣，它们可用于作物保护。很多人都知道印苦楝子素，但对其直接的前体知之甚少。因此，我也对这些鲜为人知的中间体很感兴趣，我们可能会在往印苦楝子的路上找到它们。也许这些化学物质中的一些物质在植物中以低水平积累，具有尚未被评估的有趣活动。也许如果我们能够了解获得印苦楝子素的生物合成途径，我们可以评估沿途鲜为人知的柠檬苦素的生物活性。如前所述，由于其潜在的制药用途，印苦楝内酯（nimbolide）是另一个非常有趣的目标，并且与印苦楝子素相比，则相对简单！

问：除了这项研究，你还对哪些其他研究领域感兴趣？
答：如果我把对柠檬苦素的热爱放在一边，我通常会对天然产品著迷。我认为令人难以置信的是植物、微生物甚至海洋海绵如何产生如此巨大的化学多样性，以及它们必须经历多么极端的压力才能进化。我还发现植物与微生物的相互作用，无论是有益的还是有害的，都非常有趣。我认为像根瘤菌和豆科植物这样的共生体真的很神奇，我再次发现围绕这些进化的生物和化学机制非常令人著迷。