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Self portrait, Credit: Dr. Hannah Hodgson at John Innes Centre 揭开柠檬苦素的秘密——Hannah Hodgson博士及其合作者的一项突破性发现 约翰英尼斯中心（John Innes Centre）和斯坦福大学的联合研究小组最近揭示了制造柠檬苦素所需的完整酶，该研究发表在《科学》杂志上。柠檬苦素存在于桃花心木（Mahogany）和柑橘类（Citrus）植物中。它们被广泛用作生物农药，但在本研究之前，它们的生物合成途径尚不清楚。该团队发现并鉴定了22种参与柠檬苦素生物合成的酶，它们可以催化12种不同的酶促反应，揭示了柠檬苦素的完整生物合成途径。 柠檬苦素是一种三萜类化合物（triterpenes），具有广泛的支架修饰，导致广泛的生物活性和结构多样性。有了这个完整的生物合成途径，该团队可以轻松获得柠檬苦素，为进一步研究铺平了道路。除了生物农药，该团队还希望生产出高价值的柠檬苦素，即抗癌候选药物印苦楝内酯（nimbolide）。 我们很高兴能够采访该论文的共同第一作者、约翰英尼斯中心的博士后科学家Hannah Hodgson博士。在接下来的采访中，霍奇森博士详细阐述了他们是如何取得这一重大突破，以及柠檬苦素在临床应用和生物学研究方面的深远意义。 Seeds of Mahogany trees, Credit: Credit: Dr. Hannah Hodgson at John Innes Centre 问：祝贺你最近发表在《科学》杂志上的文章，其中揭示了植物如何制造柠檬苦素的秘密，这些柠檬苦素有可能用作抗癌药物。首先，请与我们分享你的教育和培训背景。 答：我在埃克塞特大学（英国）完成了分子生物学本科学位。这是一个广泛的学位，从生物化学到海洋生物学，包括在昆士兰大学（澳大利亚）学习一年，我喜欢它，并且真正让我大开眼界，了解到植物和作物科学的研究是多么有趣和多样化。此后，2015年，我在伯明翰（英国）的NHS测序实验室短暂担任医疗保健科学助理。然后搬到诺里奇（英国）攻读博士学位，我于2020年在约翰英尼斯中心（John Innes Centre, JIC）由安妮教授（Dr. Anne’s Osbourn）主持的奥斯本小组完成了关于柠檬苦素生物合成的研究。这是一个很棒的项目，当我开始研读博士时，这条途径完全没有特征，但随著项目的进展，该项目的广度使我能够接受大量不同的技能培训。 问：请告诉我们更多关于这项发表在《科学》杂志的研究. 答：柠檬苦素是一种化学物质（或植物天然产物），仅由属于桃花心木或柑橘科的植物所制成。在《科学》杂志上发表的文章中，我们解释了如何发现和表征生产简单柠檬苦素所需的所有酶（生物机器），如氮杂二酮（来自桃花心木家族）和 基达内酯 khidalactone A（来自柑橘家族）。文章描述了22种新酶，其中12种来自柑橘属植物，10种来自桃花心木，其中一些具有新的化学作用。例如，通过进行支架重排，我们首次发现参与非常保守的甾醇初级代谢的酶已经在桃花心木和柑橘中进化，在柠檬苦素的生物合成中发挥关键作用。 桃花心木（Mahogany）系列的工作由我和JIC的同事进行，柑橘（Citrus）则由斯坦福大学的合作者进行。这项工作面临许多挑战，例如，在我们对桃花心木酶进行微调之前，我们首先必须为苦楝（Melia azedarach，该家族中的一种柠檬苦素生产树），生成基因组和表达数据。随著基因测序技术、代谢物分析和生物技术的进步，现在可以表征真正复杂的植物天然产物途径，例如我们对柠檬苦素所做的研究。但是在2016年我开始攻读博士学位时，这项工作几乎不可能达成。 问：是什么让柠檬苦素如此有趣？ 答：柠檬苦素是一组极其多样化的化学物质（迄今为止已鉴定出 2,000 多种）。它们是一种称为三萜类化合物（triterpenes）的化学物质，具有30个碳主链的多环结构。与其他三萜类化合物不同，柠檬苦素类化合物的化学支架被广泛重排。在柠檬苦素的生物合成中，会形成一个呋喃环，导致4个碳的损失，这是我们在《科学》杂志论文中首次描述的过程。柠檬苦素生物合成中，可能会出现各种其他环开口，其中之一在我们的《科学》杂志论文中得到了表征。这些环开口，加上广泛的氧化，构成了柠檬苦素的巨大多样性，使它们让化学家如此著迷。此外，许多柠檬苦素具有生物活性，但对人类无毒，因此对人类具有当前和潜在的未来用途。最著名的例子是来自桃花心木类的印楝树的柠檬苦素，即印苦楝子素。印苦楝子素是一种有效的昆虫拒食剂/毒剂，可在环境中迅速降解，被认为对蜜蜂友好。因此，印苦楝子素是一种强大的作物保护剂，基于印楝种子的溶液可用于传统和商业配方。除了作物保护用途外，柠檬苦素的许多潜在药物用途也有报导，最突出的是印苦楝内酯（nimbolide）的抗癌作用，这是另一种印楝类柠檬苦素。 问：你在进行这项研究时，使用了什么方法和设备？ 答：首先，我们使用下一代测序技术（PacBio、Hi-C 和 RNA-seq）为苦楝（印楝的近亲）生成了基因组和表达数据。然后我们利用这些资源寻找我们怀疑可能参与柠檬苦素生物合成的候选酶。为实现这一目标，我们主要采用表达分析方式（确定植物不同组织中酶的“开启”或“关闭”方式）。我们使用了苦楝（M.azedarach）的表达模式，此表达模式已经在我们于2019年发表的PNAS论文（叶柄和根中柠檬苦素生物合成酶的高表达）中建立，以找到具有相似表达模式的酶。一旦我们有了候选酶的列表，我们就克隆它们，然后在烟草类（本塞姆氏烟草）宿主植物中使用瞬时表达来测试不同的酶组合，并由一种特殊的细菌“农杆菌”做介导。该系统使酶得以在植物中表达并让我们轻松分析这些在宿主植物而非原本植物中的酶的活性。通过LCMS（液相色谱-质谱法）来分析由这些酶所引起的化学变化。最后，如果通过LCMS，我们确定了一种不知道其结构的新化学物质，我们会进行大规模的瞬时表达（使用真空渗透器来加速该过程），然后使用制备型HPLC来纯化新产生的未知化学结构。一旦我们有了一种纯化学物质，我们就可以通过NMR（核磁共振）确认其结构，以及每种酶的活性。 问：通过揭示完整生物合成途径中的酶，你的下一步研究是什么？ 答：虽然我们现在知道简单的柠檬苦素的完整生物合成途径，如氮杂二酮，但对更复杂的柠檬苦素如印苦楝子素（azadirachtin），还有更多的生物合成步骤仍然未知。我们希望了解接下来的步骤，以便能够制造出更有用/更复杂的柠檬苦素。此外，与我们发表在《科学》杂志论文中发现的22种酶一样，柠檬苦素的复杂性意味著我们很可能会在剩余的印苦楝子素途径中发现有趣且新颖的酶，这使它成为一个非常令人兴奋的项目。最后，我也对如何提高寄主植物（本塞姆氏烟草）的柠檬苦素产量感兴趣。鉴于如果我们能够制造更多的柠檬苦素，这对工业和一般人类来说可能更有用。